Q1：Label-Free Quantification (LFQ)的技术特点是什么？
A1：
1、无需化学或同位素标记
直接基于质谱信号进行定量，避免了标签引入的额外步骤与成本。
2、准确度略低于标记定量
由于缺乏内源性或外源性标签的校正，LFQ 的定量精确性通常略低于 SILAC、TMT 等标记方法。
3、样本通量高、灵活性强
不受标签通道数量限制，可同时分析更多样本，适合大规模研究。
4、对实验一致性要求高
定量结果易受样品前处理、液相色谱稳定性和仪器状态影响，需要严格的质量控制与归一化处理。
5、至少需要 3 个技术和生物学重复
以提高数据的统计可靠性，降低实验波动对定量结果的影响。
Q2：LFQ 主要有哪些常用定量策略？
A2：Label-Free Quantification（LFQ）主要有以下两种常用定量策略：
1、峰面积积分（Area Under the Curve, AUC）
通过提取 MS1 层面的色谱峰并计算曲线下面积，反映肽段在不同样品中的相对丰度，精度较高，适合检测信号稳定且峰形良好的数据。
2、谱图计数（Spectral Counting）
统计目标蛋白质在 MS/MS 中被采集和鉴定的谱图次数，用于估算相对丰度，方法简单，但对低丰度蛋白的敏感性较差。
Q3：在 LFQ 中，DDA 和 DIA 哪种采集模式更优？
A3：在 LFQ（Label-Free Quantification）中，DIA（Data-Independent Acquisition）通常更优，原因如下：
- DDA（Data-Dependent Acquisition）
依据信号强度选择前体离子进行碎裂，适合探索性鉴定，但低丰度肽段易漏检，跨样本数据缺失率较高。
- DIA（Data-Independent Acquisition）
采用全谱采集方式，覆盖所有前体离子，数据重复性和一致性好，缺失值率低，尤其适合大规模、多批次 LFQ 项目。
总结：若目标是提高定量一致性、减少缺失值并适应大规模比较分析，推荐 DIA；若是以新蛋白发现为主的探索性研究，DDA 仍有应用价值。
Q4：为什么无标记定量蛋白质组学，可以比较不同类型的样品？
A4：无标记定量基于质谱信号强度或谱图计数进行相对定量，不依赖统一的化学或同位素标签。只要不同类型的样品在前处理、色谱条件、质谱采集和数据分析流程上保持一致，并通过保留时间对齐等算法识别相同肽段，就能实现跨样品类型的蛋白丰度比较。
Q5：如何解决 LFQ 中的缺失值问题？
A5：无标记定量蛋白质组学本质上依赖质谱信号的强度对蛋白质进行相对定量，因此，任何一个步骤的波动，如样本前处理、液相分离稳定性、质谱仪性能状态等，都会导致信号丢失或检测不到，表现为数据矩阵中的大量缺失值（Missing Values）。
为减少缺失值影响，可采取以下措施：
1、优化样品前处理，降低蛋白降解与肽段损失。
2、保持色谱与质谱系统稳定，减少峰漂移与信号波动。
3、增加技术和生物学重复，提高检测覆盖率与统计可靠性。
4、采用 DIA 等全谱采集模式，降低低丰度肽段漏检率。
5、在数据分析中合理填补缺失值（如低丰度假设插补），并结合归一化提高比较精度。
Q6：进行 LFQ 时，如何处理共享肽段（shared peptides）？
A6：共享肽段是指来源于多个蛋白质、序列完全相同的肽段。处理方式主要有两种：
1、排除法：在定量计算中仅使用 wéi yī 肽段（unique peptides），避免共享肽段引入的归属不确定性。
2、分配法：基于概率模型或肽段在各蛋白的 wéi yī 肽段信号比例，将共享肽段信号按比例分配到对应蛋白，从而保留更多定量信息。
选择方法取决于研究目的：探索性研究可优先保留信息（分配法），而高精度定量通常倾向于排除法。
Q7：在 LFQ 中，如何判断定量结果的显著性？
A7：需结合统计检验（如 t 检验、ANOVA）与多重假设检验校正（FDR 控制），并建议结合生物学重复计算变异系数（CV）来评估定量的稳健性。
Q8：非标记定量蛋白质组学和标记定量蛋白质组学的适用场景有何差别？
A8：
1、非标记定量（LFQ，尤其是 DIA 模式）
更适合样本组数较多（通常超过 10 组）、来源差异较大（不同物种、组织或部位）的平行蛋白组定量研究。适用于需要判断蛋白是否存在、追求高精度定性与定量、并希望避免标签或分组带来的系统误差的项目。同时，采集的数据可多次进行深度挖掘与再分析。
2、标记定量（如 TMT、iTRAQ、SILAC）
更适合同时比较的样本数较少（通常 ≤10 组），且样本背景一致性较高（同一物种、相同类型样本）的实验设计。在这些情况下，标记定量能在单次质谱运行中实现多样本的高精度比较，降低批次效应。
Q9：如何在 LFQ 中判断“有无”表达差异？
A9：对同一样本的多次质谱检测结果通常不会完全一致，重叠率大概为70%。为了后续统计分析的合理性，一般仅保留在三次技术重复中至少两次被鉴定（即具有非零定量值）的蛋白质，并以平均值进行定量。如果某蛋白在一组样本的三次重复中均无定量值（或定量值为零），而在另一组中至少两次出现非零定量值，则可初步判断存在“有无”差异。不过，这类差异的结论需谨慎对待，建议结合其他验证手段（如 PRM、Western blot）进行确认。
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